Gran parte delle donazioni che AIL Milano riceve sono dexdicate a progetti di ricerca che da sempre sono condotti dall’autorevole guida di un Comitato composto da esperti di rilievo della comunità scientifica. Si tratta di studi che hanno lo scopo di facilitare diagnosi tempestive, ma anche di individuare cure personalizzate per rendere sempre più efficaci e meno invasivi i trattamenti terapeutici.
Nel 2022 abbiamo finanziato due importanti progetti dell’Istituto Nazionale dei Tumori di Milano di cui vi riportiamo i risultati scientifici.
Monitoraggio non invasivo della Malattia Residua in pazienti trattati con cellule CAR-T utilizzando approcci di sequenziamento di nuova generazione
Scopo di questo studio è definire una strategia e la tempistica per monitorare la risposta alla terapia con cellule CAR-T (Linfociti T autologhi ingegnerizzati con recettore antigenico chimerico) somministrata ai pazienti con linfomi aggressivi (linfomi a grandi cellule B, linfomi primitivi del mediastino), utilizzando approcci di sequenziamento di nuova generazione (NGS) su campioni di plasma prelevati a diversi tempi prima e dopo la terapia. Nello specifico gli obiettivi sono:
• Valutare biomarcatori di risposta che influiscono sulla sopravvivenza. L’analisi delle mutazioni sul cfDNA mediante sequenziamento di nuova generazione (mutNGS) viene eseguita nei pazienti affetti da linfoma aggressivo prima e dopo la terapia; i risultati vengono correlati con gli esiti delle valutazioni radiologiche.
• Indagare il panorama mutazionale dei pazienti con linfoma primitivo del mediastino (PMBCL) durante la terapia e alla ricaduta. Vengono analizzate le mutazioni del DNA tumorale circolante (ctDNA) attraverso l’analisi MutNGS per identificare possibili mutazioni specifiche della ricaduta.
Sono stati studiati 26 pazienti affetti da PMBCL recidivati o refrattari a terapie standard, trattati con cellule CAR-T presso il nostro Istituto. Il DNA libero circolante (cfDNA) è stato ottenuto da campioni di plasma di pazienti raccolti prima della terapia CAR-T, 14 e 30 giorni dopo la terapia, per un totale di 95 campioni analizzati. L’estrazione di cfDNA è stata effettuata con successo in tutti i 95/95 campioni.
Abbiamo riscontrato mutazioni somatiche nei campioni e geni più frequentemente mutati (B2M e STAT6, SOCS1, TP53 e altri), che confermano la somiglianza genotipica tra PMBCL e il linfoma di Hodgkin.
Inoltre, con un sistema di analisi genetica altamente specifico, abbiamo calcolato i livelli di DNA tumorale circolante (ctDNA) per ciascun campione analizzato. Correlando i livelli di ctDNA e lo stato della malattia al giorno 30 post CAR-T, è stato evidenziato che pazienti in remissione clinica (CR) erano caratterizzati da assenza di ctDNA nel plasma; mentre tra i 10 pazienti in risposta parziale o con malattia stabile o in progressione, 5 risultavano avere ancora ctDNA. E’ inoltre interessante notare che tutti 5 i pazienti non-CR al giorno 30 ma caratterizzati da livelli di ctDNA non rilevabili, hanno poi risposto alla terapia al giorno 90. Complessivamente, i livelli di ctDNA sono significativamente elevati nei pazienti che non hanno risposto alla terapia con cellule CAR T al giorno 90 rispetto a quelli che hanno risposto.
Emerge come il monitoraggio del cfDNA rappresenti un metodo rapido, non invasivo per il paziente, e quindi frequentemente ripetibile nel tempo, per la valutazione dello stato di malattia e della risposta alla terapia con cellule CAR-T. Inoltre, i dati da noi ottenuti suggeriscono la possibilità di utilizzare i livelli di ctDNA come bio-marcatore precoce in grado di predire la probabilità di risposta e permettere un adeguato follow-up del paziente.
Obiettivi futuri: Proseguiremo con l’identificazione delle mutazioni somatiche che verranno utilizzate su una più ampia casistica di pazienti in modo da studiare il landscape mutazionale dei pazienti con linfoma trattati nel nostro istituto con la terapia CAR-T. Il poter ampliare ulteriormente la casistica di pazienti ci permetterà di svolgere significative analisi statistiche.
Terapia CAR-T nei linfomi:
biomarcatori di risposta precoce e tossicità
La composizione fenotipica delle cellule CAR-T anti-CD19 commerciali influisce sull’espansione in vivo e sulla risposta alla terapia nei pazienti con linfoma a grandi cellule B
Negli studi clinici, espansione e persistenza delle cellule CAR-T nel paziente sono correlate all’efficacia terapeutica. Tuttavia, le proprietà delle cellule CAR-T che consentono la loro proliferazione in vivo devono ancora essere definite. Abbiamo perciò analizzato le cellule residue ottenute dopo il lavaggio di 61 sacche di reinfusione CAR-T per identificare (1) le caratteristiche fenotipiche associate all’espansione in vivo delle cellule, (2) alla risposta e (3) alla sopravvivenza dei pazienti. Le analisi sono state fatte comparando due prodotti CAR-T commerciali impiegati nel nostro Istituto: Tisa-cel e Axi-cel. Queste analisi hanno evidenziato che sebbene i prodotti Tisa-cel e Axi-cel siano caratterizzati da differenze significative nella composizione T cellulare, le loro cinetiche di espansione sono simili. L’espansione delle cellule CAR-T in vivo è risultata influenzata dalla presenza di cellule CAR+ CD8+ in entrambi i prodotti di infusione ed è risultata positivamente associata alla risposta e alla sopravvivenza libera da progressione (PFS).
I nostri dati indicano che lo stato di differenziazione delle cellule infuse media la proliferazione in vivo delle cellule CAR-T e che il numero delle cellule CAR-T circolanti può essere utilizzato come biomarcatore di risposta. Quindi, le caratteristiche dei prodotti Tisa-cel e Axi-cel possono essere valutate in anticipo per ottenere informazioni sulla loro capacità di espansione in vivo, necessaria per la massima efficacia delle cellule CAR-T, favorendo quindi una strategia di intervento precoce.
I risultati di questo studio sono stati pubblicati recentemente sulla rivista scientifica Clinical Cancer Research
L’espressione di 4 geni nei linfociti T raccolti prima della produzione delle cellule CAR-T correla con la sopravvivenza dei pazienti con linfoma a grandi cellule B che ricevono terapia con CAR-T commerciali
Ci siamo poi chiesti se fosse possibile prevedere quali pazienti beneficiassero dalla somministrazione di questa terapia. È stato infatti dimostrato in studi preclinici e clinici che l’idoneità dei linfociti T raccolti al momento dell’aferesi influenzano l’espansione in vivo delle cellule CAR-T e quindi la loro attività antitumorale. Tuttavia, risulta poco chiaro se le caratteristiche delle cellule T pre-produzione (prima che vengano ingegnerizzate con il recettore antigenico chimerico) influenzino in modo significativo l’esito dei pazienti con linfoma a cellule B trattati con tali terapie.
Abbiamo pertanto valutato se le caratteristiche fenotipiche delle cellule T della linfocitoaferesi (raccolta dei linfociti T dal paziente) avessero un impatto sull’espansione post-infusione di Tisa-cel e Axi-cel in vivo e sull’efficacia clinica. Il fenotipo delle cellule T raccolte da 55 pazienti è stato caratterizzato a livello molecolare (proteine) e genetico (mRNA).
Nessuna differenza nelle frequenze dei linfociti T di diversa natura è stata osservata quando i pazienti sono stati stratificati in base al sesso, all’età, al numero di trattamenti precedenti, al tipo di malattia (linfomi diffusi a grandi cellule, n=40; linfomi follicolari trasformati, n=6; linfomi primitivi del mediastino, n=9) e al prodotto CAR-T (Tisa-cel n=22, Axi-cel n=33). Tuttavia, la concentrazione mediana di cellule CAR-T al giorno 10 dopo l’infusione ha diviso i pazienti in 2 gruppi, coloro che avevano espanso (EX, n=28) e coloro che avevano espanso poco le cellule in vivo (PEX, n =27). Ciò è rilevante in quanto la cinetica (velocità di espansione) delle cellule CAR-T è predittiva della risposta e della sopravvivenza.
Abbiamo quindi caratterizzato il profilo di espressione dei geni nelle cellule di 36 pazienti (19 EX e 17 PEX) che avevano ricevuto Tisa-cel (n=16) e Axi-cel (n=20), e identificato un modello a 4 geni in grado di distinguere EX e PEX e separare i pazienti con diverse probabilità di sopravvivenza. Il potere predittivo del modello a 4 geni è stato confermato e ha ottenuto un’accuratezza complessiva >95% (con solo 2/36 campioni classificati erroneamente).
Il nostro studio evidenzia che le linfocitoaferesi non manipolate hanno caratteristiche che influenzano l’espansione delle cellule CAR-T in vivo e la sopravvivenza dei pazienti trattati con Tisa-cel e Axi-cel. In aggiunta, la firma genica identificata può rappresentare un biomarcatore predittivo pre-produzione dell’efficacia delle cellule CAR-T e permettere la scelta più adatta per ciascun paziente tra le terapie recentemente approvate.
Obiettivi futuri: il progetto valuterà i seguenti aspetti biologici e clinici: (a) le caratteristiche della malattia del paziente prima dell’infusione, comprese le diverse istologie dei linfomi a cellule B; (b) la genetica delle diverse malattia (includendo la presenza di alterazioni e mutazioni specifiche; (c) Il tipo di precedenti linee di terapia e il loro contributo nel modificare l’idoneità dei linfociti T.
